目的：探讨单次椎间孔注射臭氧在溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)脱髓鞘神经病理性疼痛模型中对背根神经髓鞘相关糖蛋白(myeline-associatedglycoprotein,MAG)及肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)表达的影响。方法：健康成年雄性小鼠鞘内注射1nmolLPA进行神经病理性疼痛造模，造模后24h将小鼠随机分为:人造脑脊液[LPA+aCSF(artificialcerebralspinalfluid)]组和臭氧(LPA+O3)组。同节段椎间孔分别单次注射aCSF或臭氧。在注射LPA前(t0)、注射臭氧或aCSF前(t1)、注射臭氧或aCSF后24h(t2)、3天(t3)、7天(t4)、14天(t5)时进行疼痛行为学检测（每组8只，共48只），并用蛋白质免疫印迹法在不同时间点(t0-t4)检测背根神经髓鞘蛋白MAG及TNF-α的表达变化（每组3只，共30只）。结果：①与人造脑脊液组对比，臭氧注射后24h机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期显著上升，维持到第7天；②与人工脑脊液组对比，臭氧注射后24hTNF-α表达显著下降，3天时 ，并维持到第7天；③与人工脑脊液组对比，臭氧组注射后24h和3天MAG的蛋白定量表达稳定，无进一步降解，仅在第7天时稍下降。结论：在溶血磷脂酸脱髓鞘神经病理性疼痛中单次椎间孔注射臭氧通过抑制炎症因子释放以及维持MAG稳定性可以明显缓解神经病理性疼痛。
关键词：溶血磷脂酸；背根神经；髓鞘相关糖蛋白；肿瘤坏死因子α；臭氧
大量的研究证实溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)在神经病理性疼痛的启动和维持中起着重要的作用，这意味着LPA是治疗神经病理性疼痛的一个重要的靶点。我们的前期研究也证实，鞘内注射LPA可以诱导背根神经脱髓鞘产生神经病理性疼痛。医用臭氧(ozone,O3)在临床上被用于治疗各种形式的疼痛包括带状疱疹后神经疼痛和三叉神经痛，这说明臭氧治疗神经病理性疼痛效果较好。国内外对医用臭氧在动物实验中对神经病理性疼痛的研究较少，关于臭氧在LPA诱导的脱髓鞘神经病理性疼痛中的作用尚未见研究报道，臭氧在神经病理性疼痛的具体作用机制目前不明。炎症因子，如肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)在神经病理性疼痛启动中的作用也一直被受重视。而髓鞘相关糖蛋白(myeline-associatedglycoprotein,MAG)在髓鞘的形成和维持中也发挥着关键的作用。本研究将探讨单次椎间孔注射(intervertebralforameninjection,IVF)臭氧在LPA脱髓鞘神经病理性疼痛模型中对TNF-α及MAG表达的影响。
方?法1.实验动物
本研究采用健康成年雄性小鼠（体重20～24g），动物由南华大学动物中心提供。室温保持50%～60%的湿度和在22±2℃，12h/12h黑夜-白天循环照明。动物在安静环境中分笼饲养，能自由摄取食水。所有实验步骤都尽量减轻动物的痛苦并按照有关实验动物的使用原则操作。LPA脱髓鞘疼痛模型制作：LPA鞘内注射采用Hylden和Wilcox等描述的方法，在L5和L6之间的间隙进行。造模后，将小鼠随机分为人造脑脊液组（LPA+aCSF组）及臭氧组（LPA+O3组），椎间孔臭氧或aCSF注射按照Ferrari等描述的方法，在L5左侧椎间孔处注射。于注射LPA前(t0)、注射LPA后24h且注射臭氧或aCSF前(t1)、注射臭氧或aCSF后24h(t2)、3天(t3)、7天(t4)、14天(t5)时测定小鼠机械缩足反射阈值(mechanicalwithdrawalthreshold,MWT)及热缩足反射潜伏期(thermalwithdrawallatency,TWL)，每组8只，共48只，并在不同时间点(t0、t1、t2、t3、t4)取其背根神经采用Westernblot方法测定MAG、TNF-α的表达变化，每组3只，共30只。
2.动物行为学测定
（1）MWT测定：机械痛敏测试装置为透明的有机玻璃箱，无底，箱底为金属网制成（网格为6mm×6mm）。在动物行为学测试前为了消除心理因素，把小鼠首先放入有机玻璃箱适应1h，直至小鼠搔抓、洗脸、行走等活动完全停止，处于安静状态时为止。用传感器指针（美国IITC电子vonFrey测痛仪）通过网格垂直刺激小鼠左后肢的足心部。引起小鼠左后肢回缩的压力值即定义为MWT。设定20g的压力值为分界点，避免组织损伤，以10min的间隔对左后肢重复测量3次，3次的均值用于 的统计学分析。
（2）TWL测定：热痛敏的测试装置为有机玻璃箱，无底，箱底为可以加热的玻璃平板。在动物行为学测试前为了消除心理因素，把小鼠首先放入有机玻璃箱适应1h，直至小鼠搔抓、洗脸、行走等活动完全停止，处于安静状态时为止。将热刺激器（美国IITC）放在玻璃平板的下面，投射光源的焦点正对小鼠的左后肢的足心部。通过热刺激器上的镜子可以看到小鼠的脚底面。设定20s为界点，避免组织损伤。以10min的间隔对左后肢重复测量3次，3次的均值用于 的统计学分析。
3.给药方法
LPA是由人工脑脊液(aCSF:mMNaCl,3.8mMKCl,1.2mMKH2PO4,26mMNaHCO3,10mMglucose,pH7.4)溶解。鞘内注射是采用Hylden和Wilcox等描述的方法。以左掌压住鼠身，拇、中指按住腰骶部两侧固定，食指按在双侧骶骨前缘连线正中点（可触及L5棘突）指示进针点，以微量注射器自L5和L6之间的间隙进针。臭氧注射按照Ferrari等描述的方法。以微量注射器在L5左侧椎间孔处注射30μg/mL臭氧30μL。
4.Western印迹法测定MAG和TNF-α表达
取出不同时段、臭氧和aCSF处理后的小鼠L4-5双侧背根神经节，切割成四等份，按重量分别加入Tris裂解缓冲液（50mMTris-Hcl,PH6.8;2%SDS;10% ；ddH2O。使用前要加蛋白酶抑制剂），低温匀浆，超声破碎，rpm低温离心后取上清液。用Micro-BCA(MicroBCAProteinAssayKitpierce)法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品(20μg)加入2μL上样缓冲液，混匀后，沸水煮沸10min。取煮沸后的等量蛋白样品约30μL，加入SDS-PAGE胶孔中，于80V恒压，进行聚 凝胶电泳，然后浓缩胶电泳60min，再V恒压，分离胶电泳90min。将完整的凝胶取下，转移到铺着海绵和滤纸转移夹中组成“三明治”结构，把事先在转移缓冲液中浸泡10min的PVDF膜(MilliporeJapan)紧贴其上，排除气泡，再在转移缓冲液中mA恒流转移90min。取出PVDF膜，在TBS中轻摇5min，用封闭液（TBST,5%w/v脱脂奶粉）25℃封闭2h在10ml一抗[anti-MAG(1:,Chemicon,USA),anti-TNF-α(1:0,SigmaUSA)]稀释液中(TBST,5%w/vBSA)把PVDF膜和一抗共同轻摇孵育，4℃过夜。次日，用TBST清洗PVDF膜3次，每次10min。然后用10mL 化物酶标记的二抗[anti-MAG(1:,Chemicon,USA)anti-TNF-a(1:0,Sigma,USA)]孵育,25℃2h。用TBST清洗PVDF膜，洗脱3次，每次10min，后用1mLECL(Piercechemical,USA)室温孵育3min。排出过量液体，在暗室中使其与X光片(Kodak,Rochester,NY)紧密接触，使X光片感光数秒到数分钟。显影，定影，冲洗，晾干，扫描并进行计算机图象分析。PVDF膜用strip液50℃洗脱30min后重新封闭及加一抗二抗，以β-tubulin[rabbitanti-?-tubulinpolyclonalantibody(SantacruzUSA)1:]作为内参确认上样量基本相同。
5.统计学分析
针对行为学缩足阈值的评估，采用GraphPadPrism7.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x±SD)表示，采用双因素方差(twowayANOVA)分析。P0.05认为差异有统计学意义。Western-blotting的结果：胶片用imageJ进行条带密度分析，采用双因素方差(two-wayANOVA)分析。P0.05认为差异有统计学意义。
结?果1.小鼠热阈值及机械性阈值的变化
两组鞘内注射LPA后24h，MWT和TWL均明显降低，LPA+O3组与LPA+aCSF组相比，椎间孔注射臭氧后24h时MWT和TWL显著上升，疼痛缓解，一直持续至第7天（P0.05，见图1）。
2.注射人造脑脊液和臭氧后背根神经TNF-α表达的变化
在椎间孔注射aCSF后24h(t2)、3天(t3)，观察到LPA+aCSF组背根神经TNF-α表达较注射aCSF前(t1)变化不大，7天(t4)时表达有所下降；LPA+O3组在O3注射后24h(t2)，观察到背根神经TNF-α表达较LPA+aCSF组明显下降，3天(t3)时 ，维持至第7天（P0.05，见图2）。
3.注射人造脑脊液和臭氧后背根神经MAG表达的变化
LPA+aCSF组在椎间孔注射aCSF24h后(t2)，观察到背根神经MAG的表达较注射aCSF前(t1)明显下降，第3天(t3)时持续下降，而第7天(t4)与第3天(t3)无明显变化；LPA+O3组在O3注射24h(t2)、3天(t3)时，观察到背根神经节MAG的表达较LPA+aCSF组明显增高，维持在注射臭氧前水平，仅第7天(t4)时MAG表达较注射臭氧前出现轻微下降（P0.05，见图3）。
讨?论医用臭氧是臭氧和氧气的混合物,应用于临床治疗已有多年的历史。臭氧具有强烈的刺激性气味，在常温下半衰期约20～30min，数小时后自然分解。臭氧具有很高的能量,很快自行分解为氧气和具有很强氧化能力的单个氧原子。在欧洲、俄罗斯和中国，臭氧对于治疗慢性疼痛有很好的可信度和治疗效果，臭氧已经广泛用于治疗各种形式的疼痛。臭氧具有抗炎、抗氧化及镇痛的作用。另一方面，在临床上我们通过皮内或神经节注射臭氧发现可以减轻带状疱疹后神经疼痛和三叉神经痛病人的疼痛症状。在1例5年带状疱疹后神经痛病人的随访研究中，通过在疱疹节段的椎间孔注射臭氧发现可以减轻病人的自发性疼痛和触觉诱发痛。本研究通过在L5左侧椎间孔单次注射臭氧，发现小鼠的机械痛敏及热痛敏1天后就明显下降了，且维持到了第7天，这与Lu等在坐骨神经压迫模型中发现不同浓度及剂量臭氧减轻神经病理性疼痛的时间点有很大的相似性，说明了单次剂量的臭氧可以维持很长时间。而且在LPA脱髓鞘动物模型中的研究与Luo等发现的椎间孔注射臭氧可以减轻触觉诱发痛是一致的，虽然维持时间未达到28天。但是关于不同浓度臭氧及不同剂量臭氧在LPA脱髓鞘神经病理性疼痛中的作用，需要我们进一步去探索。
TNF-α是神经损伤以及神经炎症过程中最重要及最早释放的致炎细胞因子。在本研究中我们通过单次椎间孔注射臭氧后，观察到背根神经TNF-α的表达在注射后12h立即表达下调，24h下降达到峰值，并维持到第3天，这证实了在LPA脱髓鞘神经病理性模型中臭氧对TNF-α有明显的调节作用。但维持时间较短，这可能与臭氧注射方式的不同及臭氧浓度的不同相关。LPA启动神经病理性疼痛的一个机制是诱导外周神经的脱髓鞘。髓鞘不仅仅对神经动作电位的快速传导是必需的，还对维持轴突的完整性是非常重要。MAG是一种跨膜的糖蛋白，选择性的固定于外周施旺细胞和中枢少突胶质细胞髓磷脂鞘的轴突外周（结旁区paranode)，因此认为其介导胶质细胞和轴突之间的信号传递。P?iv?l?inen等在离体实验当中证实了MAG在髓鞘形成当中的表达要早于MBP，所以我们认为MAG在髓鞘的形成和维持中发挥着重要的作用。另外，我们前期的试验研究证实单次鞘内注射LPA24h后背根神经MAG明显的下降，一直持续到第3天，这也直接说明了MAG的降解参与了LPA1受体诱导的背根神经脱髓鞘。
在本次试验中。我们通过同节段L5左侧椎间孔单次注射臭氧，发现背根神经MAG的表达未明显下降，且可以维持MAG表达不变到第3天，直到第7天的时候才出现下降。这说明臭氧能维持MAG的完整，第7天时候的下降与LPA引起MAG下降的固有维持时间有关系。之前我们的实验研究证实LPA诱导MAG下调是通过钙蛋白酶通路来调节，是否臭氧通过抑制上游的钙蛋白酶来保持MAG表达不变，这是我们需要思考和进一步研究的。另外，在LAP诱导的脱髓鞘模型中，我们还观察到MBP、PMP22、和MPZ等髓鞘蛋白降解，臭氧是否能抑制这些髓鞘蛋白的降解，这也是我们需要进一步探讨的。有文献报道RhoA信号通路是调节神经轴突再生的主要信号通路。抑制Rho信号通路对于促进轴突再生，减少细胞死亡，改善中枢神经系统损伤及引起的疼痛，是一种很好的方法。而转录因子对于髓鞘形成的调节包括正性调节和负性调节。Parkinson等年在体外实验中证实了转录因子c-Jun对施旺细胞的增殖和死亡是必需的，而且在髓鞘形成的时候c-Jun通过Egr2下调。近期的研究也证实非甾体类的消炎镇痛药物可通过抑制RhoA信号通路激活促进神经轴突的再生而减轻脊髓损伤的症状，而臭氧同样具有抗炎作用，所以我们下一步的研究也将进一步阐述臭氧是否能调节上游水平的钙蛋白酶和RhoA信号通路表达来减轻神经病理性疼痛。
本研究通过探讨臭氧在LPA脱髓鞘神经病理性疼痛中对TNF-α和MAG表达的影响来进一步阐述臭氧在神经病理性疼痛中的具体作用机制，证实了臭氧能减轻神经病理性疼痛，是治疗神经病理性疼痛的一个很好的方法。
[1]陈珊雅,彭良玉,王喜连,周忠群,唐杰,谢斌,陈素昌.臭氧抑制溶血磷脂酸引起的神经病理性疼痛和背根神经髓鞘相关糖蛋白及TNF-α上调[J].中国疼痛医学杂志,,27(01):41-46.
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