培养参数会影响CHO细胞生长、重组蛋白表达、蛋白糖基化、细胞代谢物和其他因素。生物反应器设计用于在CHO细胞中培养用于RTP生产的悬浮培养物。细胞通过CO2振荡摇床、摇瓶、滚瓶扩增后，接种在生物反应器中进行传代生长。对于补料分批培养，生物反应器中的培养环境参数通常通过实验设计(DoE)或一次单因素(OFAT)研究进行优化，这些优化包括温度、溶解氧(DO)、渗透压和pH值等。
一、培养温度
培养降温一般在指数生长期进行。为了减少细胞凋亡和促进抗体合成，将培养温度从37℃切换到29℃至35℃的较低温度。低温对完整细胞密度、细胞活力和细胞比生产力具有积极影响。比如：使用补料分批培养过程培养表达人促红细胞生成素(hEPO)的CHO细胞时，低温不仅有利于提高CHO细胞表达重组蛋白的比生产力，而且显着增加了编码未折叠蛋白反应特异性转录激活因子的基因，降低了蛋白降解的可能性；低温还通过调节细胞周期来增强hEPO的表达.
细胞培养温度可以影响CHO细胞中的VCD和蛋白质表达。当表达抗CD20mAb的CHO细胞在35°C、33°C和31°C下培养并在第3、6和9天添加补料培养基时，35°C可以增加细胞密度和抗-CD20单克隆抗体。生产中也会使用通过低温条件上调与抑制细胞凋亡、促进细胞生长和CHO细胞中miRNA表达的方法来增加IgG的产生。因此，低温是细胞培养正常的因素之一。
二、渗透压
在补料分批培养的培养后期，营养补充和代谢副产物积累能够增加细胞外渗透压。补充营养和碱都可以增加培养环境的渗透压。在补料分批过程中，NaCl保持高渗透压。它增加了mAb的滴度，减少了半乳糖基化，并增加了高甘露糖糖基化的比例。连续培养导致重量克分子渗透压浓度低于mOsm/kg可将高甘露糖糖基化降低至低于5%，并将单克隆抗体的产量提高至10g/L。
实验证明：高渗透压对CHO细胞中蛋白质糖基化是有影响的。比如：添加甜菜碱后渗透压达到mOsm/kg以上，CHO细胞中的Fc融合蛋白唾液酸化减少。无机盐和高进料量会导致补料分批培养中的高渗透压。尽管高渗透压提高了细胞特异性生产力对CHO细胞的影响,但增加高甘露糖的比例可以抑制CHO细胞的生长。科学家曾对高渗透压暴露的CHO细胞和对照细胞进行了蛋白质组学研究，并分别在补料分批培养的第2天、第6天和第8天采集细胞样本。通过蛋白质印迹分析在第2、6和8天取样的高渗透压暴露细胞组和对照细胞组的全蛋白裂解物。Septins蛋白在高渗处理后第6天上调约2-3倍，在第8天上调约1-3倍。将CHO细胞暴露于高度浓缩的补料培养基会导致渗透压在细胞生理学、形态学和蛋白质组方面增加超过mOsm/kg。因此，在补料分批培养中，适当的添加剂可以获得适宜的渗透压。
三、酸碱度
细胞培养物的pH值需要优化才能产生高质量的重组蛋白。CHO细胞生长的pH范围为7.2至7.6之间。表达抗血管内皮生长因子（VEGF-MA）mAb的CHO细胞在3L生物反应器中培养，并优化培养条件。通过加入碳酸氢钠调节pH。当pH值设置为7.10时，VEGF-MA的产量增加到4.1g/L，电荷异质性、糖基化水平和蛋白质纯度分别为26.1%、59.1%和95.1%。在设计补料分批培养的pH值时，必须遵循CHO细胞的标准pH值范围。如果细胞培养物的pH值保持在6.8以下或7.6以上，CHO细胞的生长就会受到负面影响。细胞培养物的pH通常由CO2和无机盐相互作用调节，以促进CHO细胞生长，从而实现重组蛋白的大规模生产。
四、溶解氧
DO是大规模过程中的关键环境参数之一，它影响细胞生长和重组蛋白生产。CHO细胞中的大多数DO值通常在20%到50%的范围内。在补料分批培养模式下，当DO值为20%时，重组促甲状腺激素(rTSH)的末终滴度为1.6mg/L.实验中发现，将DO值调整为40%，表达人IgG1mAb的CHO细胞在提供有乙酸铜和柠檬酸铁的补料分批培养物中培养。mAb的产量在14天的补料分批培养中达到10g/L以上，乙酸铜和柠檬酸铁减少了man5含量和mAb的酸性电荷变体，并增加了G1F的比例。
五、补料培养策略
除了调整补料培养基的组成和设置合理的工艺参数外，还需要设计和开发可用的补料策略以生产高产和高质量的重组蛋白。在饲养策略方面应考虑控制标准和补料方式。将一种或两种主要营养素的浓度保持在理想水平是通过控制标准完成的。根据化学计量饲料组成，将剩余的营养物质添加到培养系统中。生物反应器培养策略通常分为两种添加方式：连续培养和补料分批培养。分批补料培养法具有操作简单、设备要求低、生产成本低等优点。分批补料递送策略增加了单克隆抗体在CHO细胞中的表达，是大规模哺乳动物细胞培养中使用较广泛的补料分批培养方法。但是加入大量补料培养基会导致代谢副产物的积累和重量克分子渗透压浓度的增加。而连续培养则可以根据养分消耗情况调整饲喂速度以维持养分浓度。因此，连续补料在细胞培养方面更具优势。
为了促进CHO细胞中抗HER2mAb的高表达，在第3、5、7和9天添加5%的初始培养体积的补料。补料中的峰值VCD为17.1×个细胞/mL。分批培养和mAb产量达到mg/L。为了提高CHO细胞中人鼠嵌合抗表皮生长因子受体变体III（EGFRvIII）抗体C12的表达，采用连续补料策略，从第3天开始向生物反应器中加入补料培养基。与推注补料方法相比，连续补料法降低了细胞代谢副产物的比例、培养渗透压和高甘露糖型，提高了CHO细胞的VCD和活力，抗体产量超过10g/L。
使用连续补料优化补料分批培养过程来培养CHO细胞。从第4天开始，补充浓度高于g/L的葡萄糖溶液，使最终葡萄糖浓度低于5.55mmol/L。从第5天开始，连续添加含有丝氨酸的补料培养基。连续补料可降低细胞培养物的渗透压和甘露糖基化率，但会增加mAb产量。如果CHO细胞的VCD和细胞活力在指数期晚期或稳定期早期呈下降趋势，则应在细胞培养中添加补料培养基。良好的进料策略对RTP生产有积极影响。
流加培养中引入监测和控制系统，将关键细胞营养素保持在理想水平。Bolusfeeddeliverystrategy广泛用于补料分批培养，但它不能根据细胞在不同代谢阶段的动态营养消耗率调整培养基浓度。
六、补料分批培养中的代谢副产物
在细胞培养的后期，补料分批培养通常会储存乳酸和铵盐等副产物。高浓度的代谢副产物不利于细胞生长和抗体表达。CHO细胞中的葡萄糖通过糖酵解产生大量丙酮酸，部分丙酮酸使用乳酸脱氢酶进一步转化为乳酸。如果培养中使用半乳糖作为碳源，可以相应减少培养过程中的乳酸积累。
实验证明，使用表达抗HIV抗体VRC01的CHO-K1细胞在补料分批培养中培养。从第3天开始每天添加补料培养基。在细胞接种12小时后，将10mM和30mMNH4Cl添加到CHO细胞培养基中。与对照组相比，30mMNH4Cl处理组VCD和培养时间减少，乳酸、葡萄糖、铵和谷氨酰胺等副产物积累较多。特别是，铵对抗体滴度和细胞特异性生产力有负面影响.
向CHO细胞中添加包括α-酮戊二酸(α-KG)、苹果酸和琥珀酸在内的TCA循环中间体可以减少补料分批培养中乳酸和铵的积累，并提高细胞特异性生产力和抗体滴度。实践表明，使用7升生物反应器在补料分批培养中设计连续补料策略。由于7升生物反应器中有大量营养补料培养基，连续补料减少了乳酸和铵的积累，从而可以促进C12抗体的产量增加。所以，在补料分批培养中应当避免副产物，建议分批补料培养选择可用的补料策略，以降低代谢副产物积累的可能性和浓度。生物反应器中代谢副产物乳酸可以使用BiosenC-Line乳酸分析仪进行实时分析与调整。
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